一、什么是蛋白酶生理生化檢測(cè) 胰蛋白酶是胰腺分泌的一種水解酶。能水解由肽鏈相連的氨基酸類(lèi)化合物，具有酯酶活性。正常血清中含量甚微。測(cè)定血清胰蛋白酶對(duì)診斷急性胰腺炎有一定意義。它的臨床意義是升高：大多數(shù)急性胰腺炎病人及慢性腎功能衰竭病人的胰蛋白酶明顯增高，半數(shù)以上的胰腺癌及慢性胰腺炎病人的胰蛋白酶也增高。但也有20%非胰性腹痛病人，特別是膽囊炎及十二指腸潰瘍穿孔病人，胰蛋白酶也會(huì)增高。降低：胰腺外分泌功能不全(慢性胰腺炎后期)。 二、如何檢測(cè)蛋白酶 1 定義 1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在一定溫度和PH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以(u/ mL)表示。 2 福林法(第一法) 2、1 原理 蛋白酶在一琿的溫度與PH條件下，水解底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，用分光度法測(cè)定，計(jì)算其酶活力。 2、2 試劑和溶液 2、2、1 福林試劑的制備 于2000mL磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2Wo4·2H2O)100g、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL，水火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風(fēng)櫥中加入硫酸鋰(Li2SO4)50g、水50mL和數(shù)滴濃溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有綠色需再加溴水，再煮沸除去過(guò)量的溴)，冷卻，見(jiàn)水定溶至1000ml?；靹颍?/span>過(guò)濾。制得的試劑應(yīng)呈金黃色，貯存于棕色瓶?jī)?nèi)。 使用溶液：一份福林試劑與二份水混合，搖勻。 2、2、2 碳酸鈉溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L 稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 2、2、3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L 稱(chēng)取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 2、2、4 氫氧化鈉溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按GB601配制。 2、2、5 鹽酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L 按GB601配制。 2、2、6 緩沖溶液 a、磷酸緩沖液 (PH=7.5)適用于中性蛋白酶 稱(chēng)取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸緩沖液(PH=3.0)適用于酸性蛋白酶 甲液 稱(chēng)取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液 稱(chēng)取乳酸鈉(70%)16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混勻，稀釋一倍，即成0.05moi/L乳酸緩沖溶液。 c、硼酸緩沖溶液(PH=10.5)適用于堿性蛋白酶 甲液 稱(chēng)取硼酸鈉(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液 稱(chēng)取氫氧化鈉4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混勻，用水稀釋至1000mL。 上述各種緩沖溶液，均須用PH計(jì)校正。 2、2、7 10g/L酪素3)溶液 稱(chēng)取酪素1.000g，精確至0.001g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液(若酸性蛋白酶則用濃乳酸2～3滴)濕潤(rùn)后，加入適量的各種適宜PH的緩沖溶液約80 mL，在沸水浴中 邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的PH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。 注：3)酪素采用上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站經(jīng)銷(xiāo)的試劑。 2、2、8 100ug/mL L-酪氨酸4)標(biāo)準(zhǔn)溶液 a、稱(chēng)取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精確至0.0002g，用1mol/L鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即為1mg/ mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。 注：4)L-酪氨酸采用上海長(zhǎng)江生化制藥廠(chǎng)產(chǎn)品。 b、吸取1mg/ mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00 mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2、3 儀器和設(shè)備 2、3、1 恒溫水浴 40±0.2℃。 2、3、2 分光光度計(jì) 應(yīng)符合GB9721的規(guī)定。 2、4 分析步驟 2、4、1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 a、L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 按表3配制 表3 管 號(hào) | 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 ug/ mL | 取100ug/ mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 mL | 取水的體積 mL | 0 | 0 | 0 | 10 | 1 | 10 | 1 | 9 | 2 | 20 | 2 | 8 | 3 | 30 | 3 | 7 | 4 | 40 | 4 | 6 | 5 | 50 | 5 | 5 |
b、分別取上述溶液各1.00 mL(須做平等試驗(yàn))，各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL、福林試劑使用溶液1.00 mL，置于40±0.2℃水浴中顯色20min，取出，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管為空白，分別測(cè)定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(此線(xiàn)應(yīng)通過(guò)零點(diǎn))。 根據(jù)作圖或用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量(ug)，即為吸光常數(shù)K值。其K值應(yīng)在95～100范圍內(nèi)。 2、4、2 測(cè)定 (1)待測(cè)酶液的制備 a、稱(chēng)取酶粉1～2g，精確至0.0002g(或吸取液體酶1.00 mL)，用少量該酶的緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，然后將上清液小心傾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述緩沖如此溶解、搗研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度，搖勻。用四層紗布過(guò)濾，濾液根據(jù)酶活力再一次用緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，供測(cè)試用(稀釋至被測(cè)試液吸光值在0.25～0.40范圍內(nèi))。 b、酶粉測(cè)定時(shí)，稀釋倍數(shù)參考表A4(液體酶亦可參照表A4稀釋)。 表A4 酶活單位 | 總倍數(shù) | 第一次稀釋 | 第一次稀釋 | 2萬(wàn) | 2000 | 2g 200 mL（100倍） | 5 mL 100 mL（20倍） | 3萬(wàn) | 2500 | 2g 500 mL（100倍） | 5 mL 50 mL（10倍） | 4萬(wàn) | 4000 | 2g 200 mL（100倍） | 5 mL 200 mL（40倍） | 5萬(wàn) | 5000 | 2g 500 mL（100倍） | 5 mL 100 mL（20倍） | 9、10萬(wàn) | 10000 | 2g 500 mL（100倍） | 5 mL 200 mL（40倍） |
(2)測(cè)定 a、先將酷素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min; b、按下列程序操作： 試管A(空白) 試管B(酶試樣，需作三個(gè)平行試樣) 加酶液1.00 mL 加酶液1.00 mL 40±0.2℃，2min 加三氯乙酸2.00 mL(搖勻) 加酪素1.00mL(搖勻) 40±0.2℃，10min 40±0.2℃，10min 加酪素1.00(搖勻) 加三氯乙酸2.00mL(搖勻) 取出靜止10min，過(guò)濾 取出靜止10min，過(guò)濾 取1.00mL濾液 取1.00mL濾液 加碳酸鈉溶液5.0mL 加碳酸鈉溶液5.0mL 加福林試劑使用液1.00mL 加福林試劑使用液1.00mL 40±0.2℃ 顯色20min 40±0.2℃ 顯色20min 于680nm波長(zhǎng)，用10mm比色皿 于680nm波長(zhǎng)，用10mm比色皿 測(cè)其吸光度 測(cè)其吸光度 c、1.398和166蛋白酶，除反應(yīng)與顯色溫度為30±0.2℃外，其它操作同 4、2(2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)作同樣處理。 5 計(jì)算 X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n…………………(A3) 式中：X——樣品的酶活力，u/g(u/mL); A——樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度; K——吸光常數(shù); 4——反應(yīng)試劑的總體積，mL; 10——反應(yīng)時(shí)間10min，以1min計(jì); n——稀釋倍數(shù)。 所得結(jié)果表示至整數(shù)。 6 結(jié)果的允許差 平行試驗(yàn)相對(duì)誤差不得超過(guò)3%。 紫外分光光度法(第二法) 1 原理 蛋白酶在一定的溫度與PH條件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對(duì)紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定。根據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。 2 試劑和溶液 同 2。 3 儀器和設(shè)備 3、1 恒溫水浴40±0.2℃。 3、2 紫外分光光度計(jì) 應(yīng)符合GB 9721的規(guī)定。
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